Новые подходы к созданию живых модифицированных вирусных вакцин
Доклад заместителя директора ГНУ «ВИЭВ» им. Я.Р. Коваленко Алексея Забережного на Международном ветеринарном конгрессе в Казани.
23.04.2014
Источник: SoyaNews
Забережный Алексей Дмитриевич, доктор биологических наук, профессор, заместитель директора ГНУ «ВИЭВ» им. Я.Р. Коваленко, заведующий лабораторией прикладной вирусологии и биотехнологии НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского.
Алипер Тарас Иванович, доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом прикладной вирусологии и иммунологии НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского, генеральный директор НПО НАРВАК
Живые противовирусные вакцины на основе ослабленных штаммов обладают неоспоримыми преимуществами, т.к. они в точности повторяют естественный инфекционный процесс и активируют механизмы иммунного ответа, которые обеспечивают максимально эффективную защиту. Основной недостаток живых вакцин - это потенциальная способность вакцинного штамма к реверсии к дикому типу за счёт генного дрейфа, т.е. мутаций. Примером может служить вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС). Применение живой вакцины на основе аттенуированного вируса РРСС проводит к восстановлению вирулентных свойств вакцинного штамма и к его распространению (3). Другой недостаток вакцин (как живых, так и иных) - неэффективная защита против инфекции гетерологичными вирусами в случае их высокой антигенной изменчивости. Это в полной мере относится к вирусу РРСС, или например, к вирусу гриппа - несмотря на стойкий и длительный пост-вакцинальный иммунитет, каждый год создаются новые вакцины, с учётом постоянно изменяющихся антигенных свойств циркулирующих штаммов вируса.
В последние два десятилетия в вирусологии широко используется метод "обратной генетики", позволяющий синтезировать вирусы с изменёнными свойствами (5). Оба вышеупомянутых вируса (РРСС и вирус гриппа А) получают с использованием метода обратной генетики в разных лабораториях мира, включая НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского (4, 5, 6). Возможность изменять генетическую карту вирусов создаёт возможности для целенаправленного получения вакцинных штаммов с улучшенными свойствами. В последние годы стали появляться новые подходы, которые могут рассматриваться как универсальные и применяться для широкого круга вирусов. Рассмотрим их на примере вируса РРСС. Для создания эффективной вакцины против РРСС требуется решить 2 задачи:
Технология, позволяющая быстро и необратимо получать вирусы в лабораторных условиях, получила название SAVE (synthetic attenuated virus engineering). Эта технология основана на вырожденности генетического кода. Одна и та же аминокислота может кодироваться разными нуклеотидными триплетами. Некоторые триплеты, или даже "пары триплетов" (2) оказываются для вируса предпочтительнее. Например, пара аминокислот Ala-Glu в геноме вируса РРСС закодирована в нуклеотидной последовательности GCCGAA с частотой в 8,03% , или в иной последовательности - GCAGAG с частотой 6,26%. Это явление называется "codon-pair bias" (предвзятое отношение к кодонным парам) и оно напрямую связано с эффективностью белкового синтеза и количествам белков, которые накапливаются внутри заражённой вирусом клетки. Принцип метода SAVE состоит в "де-оптимизации" кодонных пар: в них вносят т. наз. "молчащие" мутации, что не затрагивает аминокислотного состава вирусных белков, но радикально снижает эффективность их синтеза и приводит к устойчивой аттенуации вируса. Данная процедура проводится методами обратной генетики в ходе синтеза вирусного генома, а внесение множественных мутаций определяется компьютерными алгоритмами (2).
В 2013 г. в США была продемонстрирована возможность быстрой аттенуации вируса РРСС при помощи данного подхода (1). Были внесены множественные мутации в ген структурного гликопротеина gp5 штамма VR2385 вируса РРСС. Этот североамериканский штамм обладает выраженными вирулентными свойствами. В указанный ген, состоящий из 603 нуклеотидов, в позициях от 148 до 546 было внесено 78 "молчащих" мутаций, что изменило значения свободной энергии макромолекулы от - 134,8 до -122,6 кКал/М. Вирус с модифицированным геном был получен в лаборатории и имел сниженные ростовые характеристики в сравнении с родительским штаммом VR2385 в перевиваемых культурах клеток Mark-145, PK-15, а также в первичной культуре альвеолярных макрофагов поросёнка. При этом у рекомбинантного вируса был снижен уровень синтеза гликопротеина gp5. Полученный вирус обладал выраженными аттенуированными свойствами - концентрация вируса в крови и в тканях лёгких у экспериментально заражённых поросят на 7-14 день после заражения была на 3 порядка ниже, чем у вирулентного родительского штамма VR2385. Так была решена проблема создания стабильно аттенуированного штамма вируса РРСС.
Другая проблема при создании вакцин против РРСС – антигенная изменчивость вируса. Известно, что продукты генов gp3, gp4, M вызывают образование вирус-нейтрализующих антител. Филогенетический анализ разных изолятов вируса РРСС, построенный на основе анализа первичной структуры указанных генов, даёт разветвлённые дендрограммы, позволяющие отнести вирус РРСС к наиболее изменчивым из известных вирусов.
Для решения данной проблемы, т.е. для создания кросс-протективного вакцинного штамма вируса РРСС, применён подход, заключающийся в случайном "перемешивании" генетических фрагментов и получении мозаичных генов (1). Б ыли выбраны 6 штаммов (MN1848, JXA1, NADC20, FL-12, VR2430, VR2385), которые могут служить референтными представителями филогенетически обособленных кластеров. При помощи методов молекулярной биологии каждый из 3 генов (gp3, gp4, M) был случайным образом составлен из генетических фрагментов, взятых из 6 указанных штаммов. Полученные мозаичные гены методами обратной генетики были встроены в геном штамма VR2385 вируса РРСС и получены инфекционные клоны. На их основе были получены рекомбинантные инфекционные вирусы с мозаичными генами - по нескольку мозаичных вариантов для каждого гена. Пролиферативные характеристики рекомбинантных вирусов не были снижены в сравнении с родительским штаммом VR2385. Данные рекомбинантные вирусы использовали для заражения животных с целью получения специфических сывороток, которые проверяли в перекрёстной реакции вирус-нейтрализации. В результате некоторые из новых вирусов демонстрировали перекрёстную нейтрализацию одновременно со штаммами FL-12 и NADC20 или со штаммами MN184B и NADC20. Таким образом, были получены вирусы РРСС с расширенной антигенной специфичностью, каких не существует в природе. Данный подход не привёл к получению вакцинного кандидата, обладающего широкой перекрёстной протективностью. Для столь изменчивого вируса, как вирус РРСС, видимо, это невозможно. Тем не менее, данный подход может быть применим для других вирусов, которые представлены ограниченным количеством выраженных серогрупп.
Таким образом, на примере вируса РРСС опробованы новые подходы, позволяющие получать стабильно аттенуированные штаммы с расширенным антигенным спектром.
Список литературы:
1. Y.Y. Ni, L. Zhou1, Z. Zhao, P. Piñeyro, C.M. Cossaboom1, S. Subramaniam1, B.J. Sanford1, Q. Cao1, B. Dryman1, D. Cao1, Y.W. Huang1, T. Opriessnig, X.J. Meng. Novel approaches for PRRSV vaccine development . Proceedings of North American PRRS Symposium, Dec 7-8, 2013, Chicago, USA. p. 28.
2. Coleman JR1, Papamichail D, Skiena S, Futcher B, Wimmer E, Mueller S. Virus attenuation by genome-scale changes in codon pair bias. Science. 2008;320(5884):1784-7.
3. Орлянкин, Б.Г.; Непоклонов, Е.А.; Алипер, Т.И.; Забережный , А.Д.; Мусиенко, М.И. Диагностика и специфическая профилактика РРСС. Ветеринария сельскохозяйственных животных. - 2006. - №12. - С. 14-16
4. Grebennikova, T.V., Clouser, D.F., Vorwald, A.C., Musienko, M.I., Mengeling, W.L., Lager, K. M. Wesley, R. D., Biketov, S.F., Zaberezhny, A.D., Aliper, T.I. , Nepoklonov, E.A. -Genomic Characterization of Virulent, Attenuated and Revertant Passages of a North American Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Strain.// 2004. - Virology. – V. 321. – 2. – P. 383-390.
5. Забережный, А. Д. Применение технологии рекомбинантных инфекционных геномов в изучении РНК-содержащих вирусов Молекулярная генетика, микробиология и вирусология . — 2004 . — N4 . — С. 13-19 .
6. Гребенникова Т. В., Забережный А. Д. , Мусиенко М. И. , Mengeling W.L., Lager, K.M. , Алипер Т. И. , Непоклонов Е. А. - Анализ геномных детерминант вирулентности и создание библиотеки полноразмерных инфекционных копий генома аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома // 2004 Вопросы вирусологии. – 3 – стр. 56-63.
Алипер Тарас Иванович, доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом прикладной вирусологии и иммунологии НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского, генеральный директор НПО НАРВАК
Живые противовирусные вакцины на основе ослабленных штаммов обладают неоспоримыми преимуществами, т.к. они в точности повторяют естественный инфекционный процесс и активируют механизмы иммунного ответа, которые обеспечивают максимально эффективную защиту. Основной недостаток живых вакцин - это потенциальная способность вакцинного штамма к реверсии к дикому типу за счёт генного дрейфа, т.е. мутаций. Примером может служить вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС). Применение живой вакцины на основе аттенуированного вируса РРСС проводит к восстановлению вирулентных свойств вакцинного штамма и к его распространению (3). Другой недостаток вакцин (как живых, так и иных) - неэффективная защита против инфекции гетерологичными вирусами в случае их высокой антигенной изменчивости. Это в полной мере относится к вирусу РРСС, или например, к вирусу гриппа - несмотря на стойкий и длительный пост-вакцинальный иммунитет, каждый год создаются новые вакцины, с учётом постоянно изменяющихся антигенных свойств циркулирующих штаммов вируса.
В последние два десятилетия в вирусологии широко используется метод "обратной генетики", позволяющий синтезировать вирусы с изменёнными свойствами (5). Оба вышеупомянутых вируса (РРСС и вирус гриппа А) получают с использованием метода обратной генетики в разных лабораториях мира, включая НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского (4, 5, 6). Возможность изменять генетическую карту вирусов создаёт возможности для целенаправленного получения вакцинных штаммов с улучшенными свойствами. В последние годы стали появляться новые подходы, которые могут рассматриваться как универсальные и применяться для широкого круга вирусов. Рассмотрим их на примере вируса РРСС. Для создания эффективной вакцины против РРСС требуется решить 2 задачи:
- Предотвратить реверсию ослабленного штамма вируса РРСС к дикому типу;
- Создать кросс-протективную вакцину, учитывая разнообразие в антигенной (рецепторной) специфичности циркулирующих вариантов вируса РРСС.
Технология, позволяющая быстро и необратимо получать вирусы в лабораторных условиях, получила название SAVE (synthetic attenuated virus engineering). Эта технология основана на вырожденности генетического кода. Одна и та же аминокислота может кодироваться разными нуклеотидными триплетами. Некоторые триплеты, или даже "пары триплетов" (2) оказываются для вируса предпочтительнее. Например, пара аминокислот Ala-Glu в геноме вируса РРСС закодирована в нуклеотидной последовательности GCCGAA с частотой в 8,03% , или в иной последовательности - GCAGAG с частотой 6,26%. Это явление называется "codon-pair bias" (предвзятое отношение к кодонным парам) и оно напрямую связано с эффективностью белкового синтеза и количествам белков, которые накапливаются внутри заражённой вирусом клетки. Принцип метода SAVE состоит в "де-оптимизации" кодонных пар: в них вносят т. наз. "молчащие" мутации, что не затрагивает аминокислотного состава вирусных белков, но радикально снижает эффективность их синтеза и приводит к устойчивой аттенуации вируса. Данная процедура проводится методами обратной генетики в ходе синтеза вирусного генома, а внесение множественных мутаций определяется компьютерными алгоритмами (2).
В 2013 г. в США была продемонстрирована возможность быстрой аттенуации вируса РРСС при помощи данного подхода (1). Были внесены множественные мутации в ген структурного гликопротеина gp5 штамма VR2385 вируса РРСС. Этот североамериканский штамм обладает выраженными вирулентными свойствами. В указанный ген, состоящий из 603 нуклеотидов, в позициях от 148 до 546 было внесено 78 "молчащих" мутаций, что изменило значения свободной энергии макромолекулы от - 134,8 до -122,6 кКал/М. Вирус с модифицированным геном был получен в лаборатории и имел сниженные ростовые характеристики в сравнении с родительским штаммом VR2385 в перевиваемых культурах клеток Mark-145, PK-15, а также в первичной культуре альвеолярных макрофагов поросёнка. При этом у рекомбинантного вируса был снижен уровень синтеза гликопротеина gp5. Полученный вирус обладал выраженными аттенуированными свойствами - концентрация вируса в крови и в тканях лёгких у экспериментально заражённых поросят на 7-14 день после заражения была на 3 порядка ниже, чем у вирулентного родительского штамма VR2385. Так была решена проблема создания стабильно аттенуированного штамма вируса РРСС.
Другая проблема при создании вакцин против РРСС – антигенная изменчивость вируса. Известно, что продукты генов gp3, gp4, M вызывают образование вирус-нейтрализующих антител. Филогенетический анализ разных изолятов вируса РРСС, построенный на основе анализа первичной структуры указанных генов, даёт разветвлённые дендрограммы, позволяющие отнести вирус РРСС к наиболее изменчивым из известных вирусов.
Для решения данной проблемы, т.е. для создания кросс-протективного вакцинного штамма вируса РРСС, применён подход, заключающийся в случайном "перемешивании" генетических фрагментов и получении мозаичных генов (1). Б ыли выбраны 6 штаммов (MN1848, JXA1, NADC20, FL-12, VR2430, VR2385), которые могут служить референтными представителями филогенетически обособленных кластеров. При помощи методов молекулярной биологии каждый из 3 генов (gp3, gp4, M) был случайным образом составлен из генетических фрагментов, взятых из 6 указанных штаммов. Полученные мозаичные гены методами обратной генетики были встроены в геном штамма VR2385 вируса РРСС и получены инфекционные клоны. На их основе были получены рекомбинантные инфекционные вирусы с мозаичными генами - по нескольку мозаичных вариантов для каждого гена. Пролиферативные характеристики рекомбинантных вирусов не были снижены в сравнении с родительским штаммом VR2385. Данные рекомбинантные вирусы использовали для заражения животных с целью получения специфических сывороток, которые проверяли в перекрёстной реакции вирус-нейтрализации. В результате некоторые из новых вирусов демонстрировали перекрёстную нейтрализацию одновременно со штаммами FL-12 и NADC20 или со штаммами MN184B и NADC20. Таким образом, были получены вирусы РРСС с расширенной антигенной специфичностью, каких не существует в природе. Данный подход не привёл к получению вакцинного кандидата, обладающего широкой перекрёстной протективностью. Для столь изменчивого вируса, как вирус РРСС, видимо, это невозможно. Тем не менее, данный подход может быть применим для других вирусов, которые представлены ограниченным количеством выраженных серогрупп.
Таким образом, на примере вируса РРСС опробованы новые подходы, позволяющие получать стабильно аттенуированные штаммы с расширенным антигенным спектром.
Список литературы:
1. Y.Y. Ni, L. Zhou1, Z. Zhao, P. Piñeyro, C.M. Cossaboom1, S. Subramaniam1, B.J. Sanford1, Q. Cao1, B. Dryman1, D. Cao1, Y.W. Huang1, T. Opriessnig, X.J. Meng. Novel approaches for PRRSV vaccine development . Proceedings of North American PRRS Symposium, Dec 7-8, 2013, Chicago, USA. p. 28.
2. Coleman JR1, Papamichail D, Skiena S, Futcher B, Wimmer E, Mueller S. Virus attenuation by genome-scale changes in codon pair bias. Science. 2008;320(5884):1784-7.
3. Орлянкин, Б.Г.; Непоклонов, Е.А.; Алипер, Т.И.; Забережный , А.Д.; Мусиенко, М.И. Диагностика и специфическая профилактика РРСС. Ветеринария сельскохозяйственных животных. - 2006. - №12. - С. 14-16
4. Grebennikova, T.V., Clouser, D.F., Vorwald, A.C., Musienko, M.I., Mengeling, W.L., Lager, K. M. Wesley, R. D., Biketov, S.F., Zaberezhny, A.D., Aliper, T.I. , Nepoklonov, E.A. -Genomic Characterization of Virulent, Attenuated and Revertant Passages of a North American Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Strain.// 2004. - Virology. – V. 321. – 2. – P. 383-390.
5. Забережный, А. Д. Применение технологии рекомбинантных инфекционных геномов в изучении РНК-содержащих вирусов Молекулярная генетика, микробиология и вирусология . — 2004 . — N4 . — С. 13-19 .
6. Гребенникова Т. В., Забережный А. Д. , Мусиенко М. И. , Mengeling W.L., Lager, K.M. , Алипер Т. И. , Непоклонов Е. А. - Анализ геномных детерминант вирулентности и создание библиотеки полноразмерных инфекционных копий генома аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома // 2004 Вопросы вирусологии. – 3 – стр. 56-63.
регион:
Россия
