Пробиотик Альтерион – альтернатива антимикробным стимуляторам роста

С. А. Молоскин, А. И. Шкурин

Прекращение использования антибактериальных стимуляторов роста в кормах для животных и птицы – серьёзный вызов для специалистов во многих странах мира. В результате широкого использования антибиотиков некоторые бактерии, в том числе патогенные для человека, выработали резистентность, которая заставила производителей мяса искать альтернативы кормовым антибиотикам, обеспечивающие как сохранение производственных показателей, так и безопасность продуктов питания.

Среди широкого разнообразия решений данной проблемы, предложенных наукой, включающих пробиотики, пребиотики, эфирные масла, органические кислоты, растительные экстракты и их комбинации, пробиотики – препараты живых культур микроорганизмов, на сегодняшний день, представляются одними из наиболее перспективных вариантов замены кормовых антибиотиков, с точки зрения ростостимулирующих свойств.

В качестве пробиотиков используются штаммы лактобактерий, бифидобактерий, энтерококков, бактерии родов Bacillus, Pediococcus, некоторые виды дрожжей и др. микроорганизмы. Среди такого разнообразия, выбор необходимого штамма для производства пробиотика представляет собой непростую задачу. Наиболее перспективной группой бактерий для создания пробиотических препаратов, предназначенных для непосредственного введения в комбикорма являются бактерии рода Bacillus из-за их способности формировать внутриклеточные споры, что позволяет им выдерживать воздействие кислоты желудочного сока, солей желчных кислот, химические и физическим факторы, возникающие в процессе гранулирования комбикорма, а также длительное хранение при высоких температурах. Кроме того, бактерии Bacillus, являются очень хорошо изученным микроорганизмами, поскольку они широко используются в современной биотехнологической промышленности. Различные штаммы Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens применяются в составе пробиотиков в течение многих лет. От пробиотиков других групп, бактерий рода Bacillus выгодно отличает механизм действия, заключающийся в синтезе широкого спектра антимикробных субстанций, подавляющих патогенные и условно-патогенные микроорганизмы. Однако, следует признать, что отсутствие постоянной эффективности в стимуляции роста и улучшении конверсии корма – главный недостаток большинства пробиотиков. Это породило серьезный скептицизм к ним не только на территории стран СНГ, но и за его пределами. Причинами такого отношения, зачастую, являются не столько особенности отечественного птицеводства – высокая концентрация поголовья и плотность посадки на предприятиях, создающие дополнительную иммунологическую и стрессовую нагрузку на организм птицы, сколько свойства самих штаммов пробиотиков, не прошедших надлежащий, научно-обоснованный отбор и обладающие как следствие недостаточной эффективностью.

Выбор штамма. Какие же существуют критерии отбора штаммов для производства пробиотика на основе бактерий рода Bacillus? Действительно, как среди такого многообразия штаммов выбрать наиболее подходящий?

Часто, в качестве пробиотиков используются микроорганизмы, отобранные по одному-двум свойствам, чаще всего, антагонистической активности in vitro в отношении определённых патогенных бактерий. Особенно печально, что в некоторых случаях, в качестве пробиотиков пытаются использовать генетически модифицированные штаммы рода Bacillus содержащие гены других живых существ, в том числе и человека, а также штаммы, используемые в биохимической промышленности или даже её отходы.

В то же время другие, важные свойства штаммов необходимые животноводству и птицеводству, остаются за рамками внимания некоторых производителей. В результате на рынке наблюдается огромное разнообразие пробиотиков на основе сенной палочки и родственных ей видов бактерий, многие из которых проявляют не постоянную эффективность, а иногда даже вызывают отрицательный результат при практическом применении. Необходимость рационального, научно-обоснованного методического подхода при отборе пробиотических штаммов вполне очевидна. При этом, очень важно использовать не только традиционные микробиологические методы, но и биологическое тестирование штаммов как на культурах клеток, для изучения физиологических свойств метаболитов данного штамма in vitro, так и на живой птице, in vivo, для оценки реальной ростостимулирующей эффективности препарата. Провести такого рода испытания могут только компании и научные центры, обладающие соответствующими материально-техническими возможностями и соответствующим опытом. Но как правило, создание высокоэффективного пробиотика не под силу одной компании, необходима кооперация узкоспециализированных научных центров.

В рамках данного подхода компаниями Novozymes и Adisseo проведена совместная работа по созданию пробиотика «Альтерион» на основе штамма сенной палочки Bacillus subtilis DSM29784, важнейшим моментом которой стал последовательный, многостадийный целенаправленный отбор необходимого штамма из более чем 900 исходных. Целью такой селекции было получение препарата, обладающего стабильной эффективностью в качестве альтернативы антибактериальным стимуляторам роста.

На первом этапе отбора были отсеяны штаммы, обладающие гемолитическими свойствами, т. е. способные разрушать (лизировать) эритроциты, но обладающие выраженной антагонистической активностью in vitro в отношении высокопатогенного штамма Clostridium perfringens. Отметим, что гемолитические свойства, очень часто, не принимаются во внимание производителями пробиотиков, в результате чего, некоторые штаммы в коммерческих препаратах являются гемолитическими, поскольку обычно (но не всегда), такие штаммы обладают одновременно сильными антагонистическим свойствами к другим бактериям. Всемирная Организация Здравоохранения относит B. subtilis к непатогенным видам бактерий, поэтому многие компании не уделяют должного внимания вопросам безопасности при разработке пробиотиков. При этом, в литературе встречаются сообщения о потенциальной опасности данной бактерии (как и других бактерий видов рода Bacillus) при иммунодефицитных состояниях человека (лейкемии, ВИЧ-инфекции).

Принципиально важным этапом селекции было, также, исключение штаммов, обладающих антибиотикорезистентностью к восьми терапевтическим антибиотикам, представляющим клинически важные для человека группы препаратов. Отсутствие антибиотикорезистентности – очень важный критерий, поскольку, если пробиотические бактерии несут в плазмидах гены устойчивости к антибиотикам, то эти гены могут быть переданы патогенным бактериям.

Помимо отбора штаммов Bacillus по принципу устойчивости к воздействию соляной кислоты в присутствии пепсина, своевременности прорастания спор в условиях желудочно-кишечного тракта, отсутствию цитотоксичности, которые с успехом прошёл шт. Bacillus subtilis DSM29784, весьма интересными оказались данные исследования штаммов на наличие про- и противовоспалительных свойств путем измерения трансэпителиальной электрической резистентности в эксперименте с тестовой культурой клеток кишечника Caco-2 (модель, традиционно используемая в фармакологических испытаниях), как при стандартных условиях, так и под воздействием индукторов воспаления, каких как интерлейкин IL-1 и фактор некроза опухолей. Штамм будущего пробиотика «Альтерион» продемонстрировал значительные противовоспалительные свойства, что выразилось в противодействии снижению проницаемости эпителиального барьера и торможении выделения клетками эпителия другого клеточного медиатора воспаления – интерлейкина IL-8, в отличие от других штаммов рода Bacillus. Как известно, противовоспалительный эффект препаратов рассматривается большинством исследователей как важнейший для любых стимуляторов роста, в том числе таких, как кормовые антибиотики, растительные экстракты и т.д. Примечательно, что, как выяснилось некоторые штаммы Bacillus даже снижают барьерную функцию эпителия как при воздействии провоцирующих воспалительные процессы агентов, так и даже при их отсутствии. Конечно, нельзя механически переносить результаты тестирования на культуре клеток in vitro на реальные условия организма-хозяина, но возможно, подобные свойства отдельных штаммов, также отрицательно сказываются на стабильности результатов практического применения, соответствующих пробиотических препаратов. Обнаруженные свойства штамма пробиотика «Альтерион», усиливать защитные функции кишечного эпителиального барьера, позднее получили подтверждение в опытах in vivo на бройлерах при гистологических исследованиях эпителия (длина микроворсинок кишечника, глубина крипт и т.п.).

Секвенирование генома различных штаммов рода Bacillus из коммерческих препаратов с целью проведения филогенетического анализа данной группы микроорганизмов по гену gyrB выяснилось, что различные штаммы пробиотиков имеют 78%-97% родства (для сравнения, человек и мышь имеют 92% общих генов). Отобранный для пробиотика «Альтерион» штамм имеет генетическое сходство с ближайшим конкурентным продуктом на рынке лишь на 90%. Таким образом, бактерии рода Bacillus имеют весьма значительные генетические различия между собой, что может существенно отражаться на их эффективности как пробиотических препаратов.

Ростостимулирующая эффективность в различных производственных условиях. Разработка пробиотика, который бы обладал стабильной ростостимулирующей эффективностью и способностью поддерживать здоровье кишечника в различных производственных ситуациях, таким образом, является непростой задачей. Заразные заболевания, особенно кокцидиоз, условия содержания птицы, такие как микроклимат и состояние подстилки, изменение состава комбикорма, повышенный ввод сырья, содержащего высокий уровень сырья с высоким содержанием некрахмалистых полисахаридов, ввод кормов животного происхождения и другие факторы, могут значительно повышать потенциал использования пробиотиков в отсутствии кормовых антибиотиков. Высокое потребление корма, присущее современным кроссам птицы, может также оказывать существенное воздействие на функционирование желудочно-кишечного тракта. Пробиотики, как и любые другие препараты, претендующие на то, чтобы стать надёжной альтернативой кормовым антибиотикам, должны иметь хорошую эффективность как в случае низкой продуктивности, при наличии каких-либо-проблем, так и при изначально высокой продуктивности птицы в нормальных условиях. Эксперименты, проведенные со штаммом B. subtilis DSM29784 показали, что ростостимулирующий эффект на цыплят-бройлеров, наблюдаемый при хорошем росте не уступает таковому, наблюдаемому на бройлерах с невысокой продуктивностью, и при этом положительное влияние на показатели продуктивности (привес и конверсию корма) не уступают эффекту кормовых антибиотиков.

Однако, для того чтобы лучше оценить эффективность препарата Альтерион, предлагаем вашему вниманию результаты одно во из экспериментов по оценки эффективности в условиях экспериментального заражения Cl. perfringens, воспроизводящего наиболее жесткие условия.

Испытания пробиотика проводились в научном центре Southern Poultry Research (Афины, штат Джорджия, США). Суть его заключалась в сравнении способности нового штамма пробиотика «Альтерион» и кормового антибиотика бацитрацина метилендисалицилата (BMD) восстанавливать продуктивность бройлеров при экспериментальном заражении цыплят, в качестве провоцирующего агента, кокцидией E. maxima в 14-дневном возрасте, с последующим искусственным инфицированием в течение 19, 20, 21 дня жизни патогенным штаммом Cl. perfringens. Как видно на рис. 1 и 2, прирост массы тела и конверсия корма у бройлеров достоверно восстанавливаются под воздействием шт. B. subtilis DSM29784 до уровня незараженной кокцидиями и клостридиями контрольной группы цыплят, при этом эффективность пробиотика не уступает эффективности бацитрацина.

Учитывая уже имеющиеся эксперименты, подтверждающие хорошая совместимость штамма B. subtilis DSM29784 с широким спектром кокцидиостатиков (монензин, салиномицин, ласалоцид, наразин, мадурамицин, диклазурил, робенидин, декоквинат, а также комплексным препаратом «Максибан»), проведенные путем подсчета КОЕ в 1 г химуса подвздошной кишки и слепых отростков, а также эксперименты на бройлерах в производственных условиях, показавшие, что кокцидиостатики не препятствуют ростостимулирующему эффекту пробиотика «Альтерион», можно говорить о данный препарат может стать реальной, надёжной альтернативой кормовым антибиотикам.


Литература.
Pierre-André Geraert, Stéphanie Pedrosa, Estelle Devillard and Stefan Jakob, Adisseo and Preben Nielsen, Novozymes. A new probiotic strain for a post antibiotic world. Gut Health - October 2016, 47.