Микотоксины. Методы определения в кормах
Микотоксины существовали еще на самых начальных этапах развития сельского хозяйства.
06.12.2011
Источник: биомедиа.рф
Микотоксины существовали еще на самых начальных этапах развития сельского хозяйства. Известно, что загрязнение микотоксинами зависит от условий окружающей среды, которые благоприятствуют росту плесени и интенсивному синтезу продуктов их жизнедеятельности. Сегодня ученые, занимающиеся этой проблемой, в первую очередь разрабатывают и активно внедряют в повсеместное использование различные методы определения микотоксинов в образцах. Для эффективной диагностики методы должны быть просты в использовании, удобны и точны.
Определение содержания микотоксинов в кормах, в первую очередь, требует совершенствования методов отбора проб и пробоподготовки, так как примерно 80% ошибок вызваны неправильным отбором анализируемой пробы. Известно, что плесени растут участками, и микотоксины распределяются неравномерно, создавая сложности для взятия представительной пробы, особенно из слежавшихся семян или неправильно смешанных кормов. Собранные образцы необходимо хранить в условиях, предотвращающих дальнейший рост плесени. Влажные образцы необходимо заморозить либо высушить, при этом требуется максимально сократить время от отбора до обработки.
При пробоподготовке образец необходимо измельчить и выделить среднюю пробу; этот этап занимает второе место по количеству ошибок анализа. Затем среднюю пробу экстрагируют. Для экстракции микотоксинов (выделение микотоксинов из сухой смеси), как правило, применяют концентрирование с помощью иммуноаффинных колонок или твердофазной экстракции.
Традиционными методами анализа микотоксинов является физико-химические методы. Наибольшее распространение нашли хроматографические методы: высокоэффективная жидкостная хроматография, жидкостная, газо-жидкостная хроматография с применением различных детекторов (масс-спектрометрического, флуоресцентного, амперометрического и т.д.). Данные методы, безусловно, способны обеспечить достаточную специфичность и необходимую чувствительность определения, однако являются дорогостоящими, рассчитаны преимущественно на специализированные и хорошо оснащенные стационарные лаборатории, а также требуют высокой квалификации персонала.
В связи с этим, важным направлением в контроле состояния кормов является разработка и внедрение в практику иммунохимических методов (ИХМ). Из-за высокой чувствительности, специфичности, экспрессности, сравнительно низкой стоимости оборудования ИХМ основаны на специфическом взаимодействии определяемого вещества (антигена) и антител. Идентификацию и количественное определение комплекса проводят с помощью введенной метки. В настоящее время доступны коммерческие тест-методы, которые могут легко решить поставленные задачи, поскольку они
-просты
-экспрессны
-портативны
-позволяют осуществить анализа на месте производства и переработки сельскохозяйственной продукции
-дешевы
-не требуют существенной пробоподготовки
-пригодны для обнаружения микотоксинов на месте без привлечения квалифицированного персонала.
При использовании экспрессных тестов результаты анализа оцениваются визуально, то есть дают качественную оценку концентрации (Да/Нет).
При разработке таких тестов стараются достичь предела обнаружения в соответствии с законодательно установленным максимально допустимым содержанием того или иного токсина в анализируемой пробе. Для контроля ложноотрицательных результатов и упрощения процедуры интерпретации в тесты вводят специальные контрольные зоны, подтверждающие как рабочее состояние тестов, так и позволяющие сравнить окраску контрольной и тестовой зон. На настоящий момент широко распространены иммунохроматографические и иммунофильтрационные тесты.
Иммунохроматографические тесты, так называемые стрип-полоски, представляют собой одностадийный метод, не требующий какой-либо аппаратуры и реагентов. Процедура проведения анализа состоит в погружении тест-полоски до контрольного уровня в анализируемый образец и последующей визуальной оценке результатов через некоторое время. В случае отсутствия определяемого токсиканта в пробе, образуют окрашенную полоску, а в случае присутствия окраска не развивается. В последнее время актуальной является разработка тестов одновременного детектирования нескольких микотоксинов.
Иммунофильтрационные тесты, получили широкое распространение после разработок иммунофильтрационных систем анализа в 80-е гг. Принцип действия основан на пропускании анализируемого раствора через мембрану, которая помещена на слой адсорбента, впитывающий проходящую через мембрану жидкость. Затем для удаления механических частиц промывают и добавляют еще серию реагентов, после чего идентифицируют результат — присутствие/отсутствие определяемого токсина в пробе.
Наряду с достоинствами данных тестов такими, как простота и экспрессность (время анализа составляет 5 — 25 мин), имеется ряд недостатков: для проведения анализа необходимо выполнять последовательное добавление реагентов, входящих в комплектацию тест-набора; на получаемые результаты влияет присутствие мешающих компонентов в образце, а также недостаточная чувствительность анализа.
Для устранения выше указанных недостатков был предложен колоночный тест-метод, в котором в качестве носителя использовали гель. Анализ осуществляли в колонке, который представляет собой несколько этапов — пропускание образца, промывку для удаления механических частиц и добавление иммунореагентов, после чего происходит развитие окраски в случае отсутствия микотоксинов в пробе и не развитие окраски в случае присутствия микотоксинов.
Данный тест позволяет сочетать в себе несколько функций:
очистка образца (за счет использования очищающего слоя в колонке)
возможность достичь высокой чувствительности за счет использования большого объема пробы
одновременного определения нескольких микотоксинов.
Заключение
Сложность определения микоткосинов в кормах связана с продолжительной и трудоемкой пробоподготовкой, а также с использованием дорогостоящих высокочувствительны методов (ВЭЖХ, ЖХ, ГЖХ). В связи с этим наиболее перспективными является применение тест-методов. Они не уступают по своей чувствительности, специфичности и простотой проведения анализа лабораторными методам.
Постоянное совершенствование аналитических инструментов и процедуры экстракции помогут устранить ошибки, также лучше понять, предсказать и выявлять наличие микотоксинов в полевых условиях.
Евгения Басова, специалист по разработке и сопровождению продукции компании «Биоэнергия», кандидат химических наук
Определение содержания микотоксинов в кормах, в первую очередь, требует совершенствования методов отбора проб и пробоподготовки, так как примерно 80% ошибок вызваны неправильным отбором анализируемой пробы. Известно, что плесени растут участками, и микотоксины распределяются неравномерно, создавая сложности для взятия представительной пробы, особенно из слежавшихся семян или неправильно смешанных кормов. Собранные образцы необходимо хранить в условиях, предотвращающих дальнейший рост плесени. Влажные образцы необходимо заморозить либо высушить, при этом требуется максимально сократить время от отбора до обработки.
При пробоподготовке образец необходимо измельчить и выделить среднюю пробу; этот этап занимает второе место по количеству ошибок анализа. Затем среднюю пробу экстрагируют. Для экстракции микотоксинов (выделение микотоксинов из сухой смеси), как правило, применяют концентрирование с помощью иммуноаффинных колонок или твердофазной экстракции.
Традиционными методами анализа микотоксинов является физико-химические методы. Наибольшее распространение нашли хроматографические методы: высокоэффективная жидкостная хроматография, жидкостная, газо-жидкостная хроматография с применением различных детекторов (масс-спектрометрического, флуоресцентного, амперометрического и т.д.). Данные методы, безусловно, способны обеспечить достаточную специфичность и необходимую чувствительность определения, однако являются дорогостоящими, рассчитаны преимущественно на специализированные и хорошо оснащенные стационарные лаборатории, а также требуют высокой квалификации персонала.
В связи с этим, важным направлением в контроле состояния кормов является разработка и внедрение в практику иммунохимических методов (ИХМ). Из-за высокой чувствительности, специфичности, экспрессности, сравнительно низкой стоимости оборудования ИХМ основаны на специфическом взаимодействии определяемого вещества (антигена) и антител. Идентификацию и количественное определение комплекса проводят с помощью введенной метки. В настоящее время доступны коммерческие тест-методы, которые могут легко решить поставленные задачи, поскольку они
-просты
-экспрессны
-портативны
-позволяют осуществить анализа на месте производства и переработки сельскохозяйственной продукции
-дешевы
-не требуют существенной пробоподготовки
-пригодны для обнаружения микотоксинов на месте без привлечения квалифицированного персонала.
При использовании экспрессных тестов результаты анализа оцениваются визуально, то есть дают качественную оценку концентрации (Да/Нет).
При разработке таких тестов стараются достичь предела обнаружения в соответствии с законодательно установленным максимально допустимым содержанием того или иного токсина в анализируемой пробе. Для контроля ложноотрицательных результатов и упрощения процедуры интерпретации в тесты вводят специальные контрольные зоны, подтверждающие как рабочее состояние тестов, так и позволяющие сравнить окраску контрольной и тестовой зон. На настоящий момент широко распространены иммунохроматографические и иммунофильтрационные тесты.
Иммунохроматографические тесты, так называемые стрип-полоски, представляют собой одностадийный метод, не требующий какой-либо аппаратуры и реагентов. Процедура проведения анализа состоит в погружении тест-полоски до контрольного уровня в анализируемый образец и последующей визуальной оценке результатов через некоторое время. В случае отсутствия определяемого токсиканта в пробе, образуют окрашенную полоску, а в случае присутствия окраска не развивается. В последнее время актуальной является разработка тестов одновременного детектирования нескольких микотоксинов.
Иммунофильтрационные тесты, получили широкое распространение после разработок иммунофильтрационных систем анализа в 80-е гг. Принцип действия основан на пропускании анализируемого раствора через мембрану, которая помещена на слой адсорбента, впитывающий проходящую через мембрану жидкость. Затем для удаления механических частиц промывают и добавляют еще серию реагентов, после чего идентифицируют результат — присутствие/отсутствие определяемого токсина в пробе.
Наряду с достоинствами данных тестов такими, как простота и экспрессность (время анализа составляет 5 — 25 мин), имеется ряд недостатков: для проведения анализа необходимо выполнять последовательное добавление реагентов, входящих в комплектацию тест-набора; на получаемые результаты влияет присутствие мешающих компонентов в образце, а также недостаточная чувствительность анализа.
Для устранения выше указанных недостатков был предложен колоночный тест-метод, в котором в качестве носителя использовали гель. Анализ осуществляли в колонке, который представляет собой несколько этапов — пропускание образца, промывку для удаления механических частиц и добавление иммунореагентов, после чего происходит развитие окраски в случае отсутствия микотоксинов в пробе и не развитие окраски в случае присутствия микотоксинов.
Данный тест позволяет сочетать в себе несколько функций:
очистка образца (за счет использования очищающего слоя в колонке)
возможность достичь высокой чувствительности за счет использования большого объема пробы
одновременного определения нескольких микотоксинов.
Заключение
Сложность определения микоткосинов в кормах связана с продолжительной и трудоемкой пробоподготовкой, а также с использованием дорогостоящих высокочувствительны методов (ВЭЖХ, ЖХ, ГЖХ). В связи с этим наиболее перспективными является применение тест-методов. Они не уступают по своей чувствительности, специфичности и простотой проведения анализа лабораторными методам.
Постоянное совершенствование аналитических инструментов и процедуры экстракции помогут устранить ошибки, также лучше понять, предсказать и выявлять наличие микотоксинов в полевых условиях.
Евгения Басова, специалист по разработке и сопровождению продукции компании «Биоэнергия», кандидат химических наук
регион:
Россия
