Влияние защищённого метионина на здоровье молочных коров

Несмотря на то, что тема аминокислотного питания молочных коров набирает всё большую популярность в России, мы всё ещё сталкиваемся с тем, что производители молока не в полной мере понимают, что это такое, и какие преимущества может получить хозяйство. Многие специалисты по-прежнему считают защищённый от распада в рубце метионин кормовой добавкой, которую используют либо в качестве средства профилактики кетозов и жировой дистрофии печени в транзитный период, либо для увеличения надоев, если другие способы не помогают. Это не совсем верно. Метионин, как и любые другие аминокислоты, является питательным веществом, по которому также необходимо балансировать рацион – подобное уже давно практикуется в свиноводстве и птицеводстве.

Для молочных коров, как и других жвачных животных метионин является ещё и первой лимитирующей аминокислотой, то есть одним из основных факторов, снижающих эффективность использования кормового белка. Связано это с тем, что все источники протеина, которые чаще всего используются в рационах уступают по содержанию метионина белку рубцовой микрофлоры – наиболее полноценному для коровы (рис.1). Причём речь в данном случае идёт о нерасщепляемом в рубце протеине, поскольку аминокислотный профиль белка, расщепляемого микрофлорой, не имеет особого значения для коровы - он будет «разобран» до более простых соединений, а затем «собран» уже в микробный протеин. Иными словами, расщепляемый в рубце белок – это источник азота для микрофлоры, нерасщепляемый – дополнительный источник аминокислот для коровы. Таким образом, при использовании любого источника транзитного протеина следует обязательно вводить в рацион защищённый метионин.

Рисунок 2 – Роль метионина в обмене веществ коровы (21)
Пояснения: CH3 – метильные группы; САМ – S-Аденозилметионин; САГ – S-Аденозилгомоцистеин; ФХ – Фосфатидилхолин; ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности

Если же говорить об эффектах, которые данная аминокислота оказывает на животных, то учитывая, что метионин – это единственная аминокислота, с которой начинается синтез любого белка (34), его нехватка может негативно сказываться практически на всех процессах, протекающих в организме, будь то синтез молочного протеина, рост плода или синтез гормонов. Влиянию метионина на молочную продуктивность и содержание белка в молоке уже было посвящено множество статей за рубежом (8, 12, 26, 30) и несколько на русском языке (И. Айснер, 2015, Защищённые аминокислоты в кормлении коров; И. Айснер, 2016, Эффективность применения защищённого от разрушения в рубце метионина Смартамин® М в кормлении молочных коров). Основной эффект, оказываемый метионином на молочную продуктивность связан как раз с увеличением эффективности использования транзитного протеина. Однако помимо участия в синтезе метионин сам по себе играет важную роль в регуляции множества других физиологических процессов (рис. 2).

Например, метионин является предшественником таких веществ как таурин и глутатион – основных антиоксидантов в организме животного. Он также необходим для выведения жиров из печени и их окисления. В данной статье мы подробнее рассмотрим все эти и многие другие функции метионина, оказывающие непосредственное влияние на здоровье молочных коров.

Насколько важны аминокислоты в транзитный период?

В период перед отёлом потребление коровами сухого вещества может снижаться несмотря на то, что потребность в питательных веществах, наоборот, увеличивается для поддержания роста плода, плаценты и тканей молочной железы (2). В первые недели после отёла потребление корма также может оставаться на низком уровне, при том, что потребности животного продолжают расти в связи с начавшейся лактацией и необходимостью восстановления после отёла. В результате сочетание этих двух факторов приводит к возникновению отрицательного баланса питательных веществ и энергии, а также дефициту некоторых макроэлементов, что в свою очередь, может вести к ухудшению функции печени и иммунитета и возникновению субклинического кетоза и других расстройств обмена веществ (11, 13, 32). В этот период организм животного мобилизует собственные резервы, в частности жиры, белки и гликоген (21). Общая масса протеина, который мобилизуется в начале лактации, может достигать 20 кг на одну корову (6, 19, 20). Большая часть этого протеина поступает из периферических тканей, в основном – скелетных мышц (23), и, в меньшей степени, из кожных покровов засчёт угнетения синтеза белков в этих тканях и усиленному протеолизу, то есть расщеплению белков (3). Высвободившиеся в результате этих процессов аминокислоты активно используются для синтеза белка молока, получения ряда других биологически активных веществ или глюконеогенеза для получения глюкозы (23).

Влияние метионина на здоровье печени

В период позднего сухостоя для обеспечения организма коровы энергией, необходимой для перестройки обмена веществ перед отёлом и лактацией, начинается мобилизация жиров из жировой ткани. В кровь они поступают в виде неэстерифицированных или, проще говоря, свободных жирных кислот (НЭЖК или СЖК), в печени из СЖК синтезируются триглицериды. Когда недостаток энергии значителен, и концентрация СЖК в крови существенно повышается, начинает снижаться чувствительность клеток к инсулину, что негативно влияет на их способность усваивать глюкозу, а это, в свою очередь, ведёт к снижению аппетита (24). В результате снижения потребления сухого вещества дефицит энергии только усиливается и стимулирует ещё более интенсивную мобилизацию жира. В итоге в клетках печени коровы в транзитный период может накапливаться большое количество жиров, что является одним из основных факторов риска развития послеотёльных осложнений (13). Накопление жиров в печени происходит в большинстве случаев из-за недостаточного синтеза липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП), которые являются основным переносчиком триглицеридов в организме. (Рис. 3).

Грюммер в 1993 году предположил, что синтез ЛПОНП из триглицеридов нарушается при недостатке в печени метионина (15). Метионин необходим для синтеза таких веществ, как аполипоротеины B и фосфатидилхолин, которые, в свою очередь, необходимы для формирования ЛПОНП. Так, внутривенное введение коровам в начальной фазе лактации L-метионина (10) в качестве предшественника фосфатидилхолина приводило к увеличению образования ЛПОНП и снижало количество жиров в печени (14).

Фактор нехватки метионина также может служить ограничением для использования защищённых жиров в качестве энергетической добавки в транзитный период, поскольку для получения из них энергии или для транспортировки к другим органам, задействуются те же процессы, что и для собственных жировых запасов тела.

Взаимосвязь между уровнем свободного метионина в плазме крови в первые две недели после отёла и тяжёлой формой жировой дистрофии печени была также обнаружена Шибано и Кавамура в 2006 году (29). В этом исследовании сравнивались концентрации десяти аминокислот, включая метионин, бета-гидроксимасляной кислоты (БОМК), которая является одним из кетоновых тел, и свободных жирных кислот в плазме крови коров с жировой дистрофией и с нормальной функцией печени (“больных” и “здоровых” соответственно). Уровень БОМК после отёла у животных первой группы был существенно выше. Концентрация СЖК у “больных” коров также сильно возрастала, хотя достоверных различий между группами обнаружено не было. Концентрация большей части свободных аминокислот в крови животных с жировой дистрофией печени имела тенденцию к снижению в течение первых 14 дней после отёла. При этом только уровень метионина существенно различался у “больных” и “здоровых” коров – у первых он был достоверно ниже (Таблица 1). Эти данные позволяют предположить, что развитие жировой дистрофии печени в транзитный период связано, в первую очередь, с недостатком метионина.

Таблица 1. Биохимические параметры плазмы крови у коров с нормальной функцией печени (НФП) и с жировой дистрофией печени (ЖДП) (29)
	Группа коров	Дни до и после отёла						АНОВА
		-30	-14	1	14	30		P1
БОМК, мкмоль/л	ЖДП	423±81	415±74	1022±331a	1287±775a	1961±1241		0.0049 **
	НФП	428±36	453±88	675±305b	610±225b	786±268
СЖК, мг-экв/л	ЖДП	301±63	298±137	779±321	1186±277a	616±336		0.0719
	НФП	172±46	194±69	744±391	639±143b	426±196
Метионин, пмоль/л	ЖДП	26±2	23±2	21±2	18±3	17±3		0.0088 **
	НФП	26±3	26±2	26±4	23±2	22±6
1 дисперсионный анализ (** – P<0,01) a, b различные буквенные индексы означают разницу при P < 0,05 между двумя группами при одновременном отборе проб.

Помимо участия в синтезе ЛПОНП метионин играет ещё одну важную роль в жировом обмене. Он необходим для синтеза карнитина (рис. 2 и 3) – вещества, которое является ключевым при транспорте свободных жирных кислот внутрь митохондрий для их последующего окисления и получения энергии (9). Более того, на данный момент известно, что карнитин имеет также ряд других важных функций в организме, таких как защита от окислительного стресса, поддержание окисления субстрата в бурой жировой ткани (данный процесс обеспечивает теплопродукцию и играет важную роль в терморегуляции) и регуляция распределения энергии в организме (34).

Результаты опыта, проведённого в 2014 году рабочей группой Осорио, демонстрируют влияние рационов, обогащённых защищённым метионином, на здоровье печени, окислительный стресс и иммунный статус коров в транзитный период (25). В данном эксперименте было задействовано три группы животных, получавших одинаковые рационы в периоды с 50 по 21 день до ожидаемого отёла, в течение 21 дня до ожидаемого отёла, а также в первые 28 дней после отёла. Контрольная группа коров получала только базовые рационы, а две другие в период позднего сухостоя и новотёла дополнительно получали защищённый метионин, Смартамин® M или МетаСмарт®. Соотношение переваримого лизина к переваримому метионину в опытных группах составляло 2,8:1. У коров, которым скармливали обогащённые метионином рационы, содержание карнитина в крови было существенно выше, а концентрация фосфатидилхолина, наоборот, имела тенденцию к снижению (Таблица 2). Это может свидетельствовать о том, что организм животных обеих опытных групп обладал более высокой способностью и к окислению жиров, и к их выведению из печени в составе ЛПОНП.

Таблица 2. Влияние МетаСмарта® или Смартамина® М на маркеры функции печени при введении в рацион в транзитный период (25).
Маркер	Рацион				P-значение
	Контроль	МетаСмарт®	Смартамин® М
Карнитин, нмоль/г ткани	37,5	98,2	66,0		0,01
Фосфатидилхолин, мкмоль/г ткани	10,6	7,7	9,1		0,15
Альбумин, г/л	35,1	36,1	35,7		0,28

Помимо этого, в плазме крови коров опытных групп после отёла наблюдалась более высокая концентрация альбумина, основная часть которого также производится в печени (25).

Опираясь на полученные результаты, авторы исследования сделали вывод, что защищённый от распада в рубце метионин способствует улучшению работы печени.

Роль метионина в защите организма от окислительного стресса и воспалительных процессов

На данный момент уже хорошо известно, что воспалительные процессы играют важную роль в возникновении послеотёльных осложнений, однако факторы и пути развития воспалений в этот период ещё не до конца ясны. В качестве самой очевидной причины можно указать различных инфекционных агентов, но они, тем не менее, далеко не всегда являются инициаторами возникающих в организме воспалительных процессов и связанных с ними осложнений (7). В частности, очень высокую частоту возникновения подобных осложнений у коров с упитанностью свыше 3,5 баллов (по 5-балльной шкале) сложно списать исключительно на инфекции (9, 28).

В данном случае причинами запуска воспалительных процессов могут служить не только инородные вещества и микроорганизмы или травмы, но и соединения, образующиеся в самом организме в процессе жизнедеятельности. К таким соединениям относятся активные формы кислорода (АФК) и липопероксиды (ЛП) (27).

Активные формы кислорода включают в себя ионы кислорода, свободные радикалы и различные пероксиды, например, перекись водорода. Они всегда в небольшом количестве образуются в митохондриях клеток печени при протекании обменных процессов, и некоторые из них могут играть роль медиаторов важных внутриклеточных сигнальных путей. Однако при повышенной концентрации они вступают во взаимодействие с другими веществами внутри клетки, окисляя их и вызывая повреждение самой клетки и её гибель. Этот процесс называется окислительным стрессом. Именно при воздействии АФК на внутриклеточные жиры и образуются липопероксиды.

Повышение интенсивности обменных процессов вследствие увеличения потребностей в энергии и питательных веществах в период после отёла ведёт к росту образования активных форм кислорода, что, наряду с увеличением концентрации свободных жирных кислот при мобилизации жировых запасов, вызывает повышенное образование липопероксидов. Этот процесс особенно активно протекает именно у коров с высокой упитанностью, что подтверждается высокой концентрацией маркеров перекисного окисления жиров (ТБК-реактивных продуктов) в плазме крови таких животных (4). Кроме того, образование ЛП повышается у животных при жировой дистрофии печени на фоне недостатка метионина и/или холина (27). Липопероксиды запускают воспалительные каскады, которые, в свою очередь, нарушают процессы обмена питательных веществ. Например, они повреждают митохондриальные ДНК, белки и мембраны, вызывая повреждение ткани печени и нарушения в энергетическом обмене (27).

Помимо окислительного повреждения клеток печени и участия в формировании липопероксидов, активные формы кислорода также губительно влияют на иммунные клетки и могут снижать способность иммунной системы противостоять инфекциям (31). Кроме того, АФК вызывают повреждение тканей молочных желёз, что приводит к росту содержания соматических клеток в молоке (35).

Организм защищается от воздействия АФК при помощи ферментов, которые называются антиоксидантами. Двумя основными антиоксидантами являются глютатион и таурин (34), и оба эти соединения синтезируются только с участием метионина (рис.2). Сильное воспаление или недостаточная антиоксидантная защита может привести к серьёзным повреждениям тканей (35).

Помимо защиты организма от окислительного повреждения, глютатион и таурин выполняют ряд других важных функций. Так, например, таурин является регулятором постоянства внутренней среды клетки, ключевым компонентом в передаче нервных импульсов и одним из компонентов желчи, то есть необходим для нормального усвоения жиров и жирорастворимых витаминов. Таким образом, это соединение оказывает положительный эффект на сердечно-сосудистую, пищеварительную, эндокринную, иммунную, нервную и репродуктивную системы (34).

Глютатион выполняет ещё больше жизненно-важных функций. В их числе синтез простагландинов – важных регуляторов работы организма, передача нервных импульсов, экспрессия генов, синтез ДНК и белков. Глютатион в определённой концентрации необходим для нормального деления клеток и роста тканей, таких как гепатоциты (печёночная ткань), трофобласты (наружная клеточная масса зародыша), лимфоциты и клетки эпителия кишечника. Он также играет важную роль в сперматогенезе, созревании спермы и развитии яйцеклеток, то есть влияет на репродуктивную функцию как самцов, так и самок. Кроме того, глютатион критически важен для активации Т-лимфоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов, а также для синтеза цитокинов – всё это необходимо для формирования успешного иммунного ответа при столкновении с инфекциями (34).

Таким образом, обеспечение коров в транзитный период метионином, необходимым для синтеза антиоксидантов, может помочь животным поддержать здоровье в течение последующей лактации.

Влияние защищённого метионина на способность противостоять окислительному стрессу демонстрируется в упомянутом ранее исследовании Осорио 2014 года. В результате проведения опыта было установлено, что у животных, получавших защищённый метионин, концентрация в крови церулоплазмина и сывороточного амилоида А была существенно ниже, чем у коров контрольной группы. Указанные соединения являются своего рода индикаторами воспалительных процессов: чем сильнее воспаление, тем выше их концентрация в крови. Соответственно у животных, получавших Смартамин® М или МетаСмарт®, интенсивность воспалительных процессов была ниже. Кроме того, у животных опытных групп наблюдался лучший антиоксидантный статус, о чём свидетельствуют более высокая концентрация глютатиона и повышенная способность к поглощению радикалов кислорода (СПРК, ORAC) (Таблица 3).

Таблица 3. Влияние МетаСмарта® или Смартамина® М на концентрации церулоплазмина, сывороточного амилоида А (САА), глютатиона и способность к поглощению радикалов кислорода (СПРК) (25).
Маркер	Рацион				P-значение
	Контроль	МетаСмарт®	Смартамин® М
Церулоплазмин, мкмоль/л	3,02	2,68	2,71		0,03
САА, мкг/мл	61,0	40,7	43,5		0,17
СПРК, моль/л	11,9	12,9	12,4		0,05
Глютатион, мМ	1,27	1,55	1,73		0,09

Ещё раньше, в 2010 году, группа исследователей под руководством Ардалана достоверно установила положительный эффект от введения Смартамина® М в рацион в транзитный период на снижение частоты проявления проблем со здоровьем (Таблица 4). Это исследование также наглядно продемонстрировало, что комбинация защищённого метионина и холина оказывает гораздо больший положительный эффект на здоровье, чем каждое из этих веществ по отдельности.

Заключение

Метионин, в силу особенностей кормления, является наиболее значимой аминокислотой для молочных коров. Он является ключевым фактором для эффективного использования кормового протеина и синтеза всех белков в организме животного. Кроме того, он выступает регулятором ряда обменных процессов и выполняет множество жизненно-важных функций. Белее чем двадцатилетний опыт применения защищённого метионина в кормлении коров доказывает, что его правильное балансирование в рационах может не только положительно повлиять на показатели продуктивности и качества молока, но и улучшить работу печени и оптимизировать иммунный и антиоксидантный статус. Это, в свою очередь, позволит поддержать здоровье животных в транзитный период, помочь легче его преодолеть и улучшить тем самым прибыльность молочной фермы.


® Владелец торговых знаков Смартамин® и МетаСмарт® компания Адиссео Франс САС, Франция

---

Список литературы

1) Ardalan M., Rezayazdi K., and Dehghan‐Banadaky M. 2010. Effect of rumen‐protected choline and methionine on physiological and metabolic disorders and reproductive indices of dairy cows. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 94: e259–e265.

2) Bell A. W. 1995. Regulation of organic nutrient metabolism during transition from late pregnancy to early lactation. J. Anim. Sci. 73:2804-2819.

3) Bell A. W., Burhans W. S., and Overton T. R. 2000. Protein nutrition in late pregnancy, maternal protein reserves and lactation performance in dairy cows. Proc. Nutr. Soc. 59:119–126.

4) Bernabucci U., Ronchi B., Lacetera N., and Nardone A. 2005. Influence of body condition score on relationships between metabolic status and oxidative stress in periparturient dairy cows. J. Dairy Sci. 88:2017-2026

5) Bertoni G., and Trevisi E. 2013. Use of the liver activity index and other metabolic variables in the assessment of metabolic health in dairy herds. Vet. Clin. Food Anim. 29:414-431

6) Botts R. L., Hemken R. W., and Bull L. S. 1979. Protein reserves in the lactating dairy cow. J. Dairy Sci. 62:433–440.

7) Bradford B. 2009. Inflammation and transition cow disorders. Proc. 4-State Dairy Nutrition and Management Conf. p.76

8) Cho J., Overton T.R., Schwab C.G., Tauer L.W. 2007. Determining the amount of rumen-protected methionine supplement that corresponds to the optimal levels of methionine in metabolizable protein for maximizing milk protein production and profit on dairy farms. J. Dairy Sci. 90:4908-4916.

9) Drackley J. K. 1999. Biology of dairy cows during the transition period: The final frontier? J. Dairy Sci. 82:2259-2273.

10) Durand D., Chilliard Y., and Bauchart D. 1992. Effects of lysine and methionine on in vivo hepatic secretion of VLDL in the high yielding dairy cow. J. Dairy Sci, 75(Suppl 1), 279.

11) Gerloff B. J., Herdt T., and Emery R. S. 1986. Relationship of hepatic lipidosis to health and performance in dairy cattle. J.Amer. Vet. Med. Assoc. 188:845-850.

12) Giallongo F., Harper M. T., Oh J., Lopes J. C., Lapierre H., Patton R. A., Parys C., Shinzato I. and Hristov, A. N. 2016. Effects of rumen-protected methionine, lysine, and histidine on lactation performance of dairy cows. J. Dairy Sci. 99:4437-4452.

13) Goff J. P. and Horst R. L. 1997. Physiological changes at parturition and their relationship to metabolic disorders. J. Dairy Sci. 80:1260-1268.

14) Gruffat D., Durand D., Graulet B., and Bauchart D. 1996. Regulation of VLDL synthesis and secretion in the liver. Reprod. Nutr. Develop.36:375-389.

15) Grummer, R. R. 1993. Etiology of lipid-related metabolic disorders in periparturient dairy cows. J. Dairy Sci. 76:3882-3896.

16) Katsumata M., Kawakami S., Kaji Y., Takada R. and Dauncey M.J. 2001. Low lysine diet selectively upregulates muscle GLUT4 gene and protein expression during postnatal development. Energy metabolism in animals EAAP publication No. 103. 237-239

17) Katsumata M., Matsumoto M., and Kaji Y. 2003. Effects of a low lysine diet on glucose metabolism in skeletal muscle of growing pigs. In: Souffrant W.B. and C.C. Metges (editors), Progress in research on energy and protein metabolism. Wageningen Academic Publishers, Wageningen, the Netherlands, EAAP publication No. 109, 187-190.

18) Katsumata M., Kyoya T., Kobayashi H., Ishida A., Ashihara A. and Nakashima K. 2013. Mechanisms of regulation of intramuscular fat deposition in porcine muscle by dietary lysine content. In Energy and protein metabolism and nutrition in sustainable animal production (pp. 253-259). Wageningen Academic Publishers.

19) Komaragiri M. V., and Erdman R. A. 1997. Factors affecting body tissue mobilization in early lactation dairy cows. 1. Effect of dietary protein on mobilization of body fat and protein. J. Dairy Sci. 80:929–937.

20) Komaragiri M. V., Casper D. P., and Erdman R. A. 1998. Factors affecting body tissue mobilization in early lactation dairy cows. 2. Effect of dietary fat on mobilization of body fat and protein. J. Dairy Sci. 81:169–175.

21) Kuhla B., Nürnberg G., Albrecht D., Görs S., Hammon H. M., and Metges C. C. 2011. Involvement of skeletal muscle protein, glycogen, and fat metabolism in the adaptation on early lactation of dairy cows. J. proteome research, 10:4252-4262.

22) Luchini D. and Loor J. 2014. The benefits of feeding methionine during the transition phase. Proc. 4-State Dairy Nutrition and Management Conf. 14-18.

23) Meijer G. A., Van der Meulen J., Bakker J. G., Van der Koelen C. J., and Van Vuuren A. M. 1995. Free amino acids in plasma and muscle of high yielding dairy cows in early lactation. J. Dairy Sci. 78:1131–1141.

24) Ohtsuka H., Koiwa M., Hatsugaya A., Kudo K., Hoshi F., Itoh N., and Kawamura S. I. 2001. Relationship between serum TNF activity and insulin resistance in dairy cows affected with naturally occurring fatty liver. J.Vet. Med. Sci. 63:1021-1025.

25) Osorio J. S., Trevisi E., Ji P., Drackley J. K., Luchini D., Bertoni G. and Loor J. J. 2014. Biomarkers of inflammation, metabolism, and oxidative stress in blood, liver, and milk reveal a better immunometabolic status in peripartal cows supplemented with Smartamine M or MetaSmart. J. Dairy Sci. 97:7437-7450.

26) Patton R.A. 2010. Effect of rumen-protected methionine on feed intake, milk production, true milk protein concentration, and true milk protein yield, and the factors that influence these effects: a meta-analysis. J. Dairy Sci. 93:2105-2118.

27) Pessayre D., Fromenty B., and Mansouri A. 2004. Mitochondrial injury in steatohepatitis. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 16:1095-1105.

28) Roche J. R., Friggens N. C., Kay J. K., Fisher M. W., Stafford K. J., Berry D. P. 2009. Invited review: Body condition score and its association with dairy cow productivity, health, and welfare. J. Dairy Sci. 92: 5769-5801

29) Shibano K. I., and Kawamura S. 2006. Serum free amino acid concentration in hepatic lipidosis of dairy cows in the periparturient period. J.Vet. Med. Sci. 68:393-396.

30) Socha M.T., Putnam D.E., Garthwaite B.D., Whitehouse N.L., Kierstead N.A., Schwab C.G., Ducharme G.A., Robert J.C. 2005. Improving intestinal amino acid supply of pre- and postpartum dairy cows with rumen-protected methionine and lysine. J. Dairy Sci. 88:1113-1126.

31) Spears J. W., and. Weiss W. P 2008. Role of antioxidants and trace elements in health and immunity of transition dairy cows. Vet. J. 176:70-76.

32) Wasserman, R. H., Comar, C. L., Schooley, J. C., & Lengemann, F. W. (1957). Interrelated effects of L-lysine and other dietary factors on the gastrointestinal absorption of calcium 45 in the rat and chick (Abstract). Journal of Nutrition, 62, 367-376.

33) Waldron M. R., 2014. Prescribed Feeding Prepartum for improved Health and Performance Postpartum. Proc. 3-State Dairy Nutrition Conf. 27-39.

34) Wu. G. 2013. Amino acids – Biochemistry and Nutrition. CRC Press, Taylor and Francis Group, 6000 Broken Sound Parkway NW, Suite 300, Boca Raton, FL.

35) Zhao X., and Lacasse P. 2008. Mammary tissue damage during bovine mastitis: Causes and control. J. Anim. Sci. 86:57-65.