Доклад руководителя департамента вирусологии Агентства ветеринарных лабораторий Великобритании Тревора Дрю на Международном ветеринарном конгрессе в Казани.

Тревор Вернер Дрю, Саймон Грэм, Хелен Крук
Агентство ветеринарных лабораторий, Уэйбридж, Великобритания


Классическая чума свиней остается глобальной проблемой и, невзирая на масштабные усилия европейских специалистов, в Восточной Европе дикие кабаны по-прежнему являются серьезным резервуаром, затрудняя борьбу с заболеванием. В настоящий момент проводятся многочисленные исследования по мониторингу распространения КЧС среди диких кабанов в таких странах, как Болгария, Румыния, Хорватия и Босния. Для их иммунизации в дикой природе размещаются приманки, содержащие оральную вакцину против КЧС на основе штамма “С”. Несмотря на высокое качество этих вакцин, к производству которых предъявляются крайне строгие требования, по-прежнему приходится признать, что очень полезным был бы диагностикум, позволяющий отличить инфицированных животных от вакцинированных (DIVA-стратегия).

Международное эпизоотическое бюро относит КЧС к заболеваниям, от которых для участия в международной торговле государство должно быть официально свободным, и ряд стран активно пользуется таким своим статусом.

Если говорить о других заболеваниях, к которым предъявляются сходные требования, таких, как ящур, то в их случае достаточно эффективного мониторинга, оповещения о случаях заболевания и постановки диагноза экспертами, ответственными за здравоохранение животных в данном государстве. Необходимости искоренять эти заболевания среди диких кабанов нет, при условии что приняты меры для предотвращения их контактов с домашними свиньями. Таким образом, становится возможна компартментализация внутри отрасли либо структурированной производственной пирамиды, кроме того, потребуется строгий мониторинг мер биобезопасности. Существующие DIVA-вакцины против КЧС основаны на вирусном белке Е2, который синтезируется с помощью бакуловирусных систем экспрессии, одновременно проводится DIVA-тест, основанный на детекции белка Erns. Препарат вводится двукратно, а иммунитет вырабатывается в течение 2-3 недель. DIVA-вакцины не на 100% предотвращают вертикальную трансмиссию вируса. В свою очередь, компонент, отвечающий за дифференциальную диагностику, также имеет свои минусы. Чувствительность ИФА-теста к белку Erns далека от идеальной, следовательно, существует риск не выявить некую часть инфицированных животных. Такой препарат ограниченно применялся в Румынии, где в основном используются маркированные вакцины в промышленных свинокомполексах и обычные живые аттенуированные вакцины на частных подворьях и для иммунизации диких кабанов. Испытания нового препарата прошли лишь с частичным успехом, и все хозяйства вернулись к своим прежним вакцинным препаратам.

Из разрабатывающихся в настоящий момент кандидатов в DIVA-вакцины наибольшие надежды подает препарат на основе химерного пестивируса CP7- E2Alf. Это вирус бычьей вирусной диареи штамма, обладающего цитопатическим действием, в котором ген Е2 замещен геном Е2 вируса КЧС штамма Alfort. Для этого препарата была показана эффективность, сопоставимая с живыми аттенуированными вакцинами на основе штамма “С”. В течение 3 дней обеспечивается высокий уровень защиты на длительное время, кроме того, препарат безвреден, в том числе для супоросных свиноматок. DIVA- компонент этой и других подобных вакцин по-прежнему основан на детекции антител, специфичных к Erns-белку вируса КЧС, сохраняется и проблема невысоких специфичности и надежности результатов. Тем не менее недавно были описаны новые ИФА-методики для обнаружения антител к белку Erns, позволяющие обнаружить их уже через 10 дней после контакта с антигеном.

В Уэйбридже мы исследуем целесообразность применения стратегий, не опирающихся на вакцинацию: например, возможность предотвращения заражения животных в случае вспышки КЧС с помощью иммунологических противовирусных препаратов – цитокинов, таких, как интерферон.

Преимущество такого подхода в том, что не индуцируется синтез антител, следовательно, и результаты последующих серологических тестов будут однозначными. Таким образом свиньи останутся здоровыми и без предшествующего опыта контакта с вирусом. В идеале для предотвращения распространения КЧС нужно стремиться к использованию противовирусных препаратов в комплексе с другими мерами контроля в зонах мониторинга или зонах защиты. Поэтому в Агентстве Ветеринарных Лабораторий в настоящий момент исследуются вопросы векторной доставки свиных интерферонов.

В основе успешной борьбы с каким бы то ни было заболеванием лежит быстрое обнаружение и идентификация патогена. Нам удалось разработать набор для дуплексного ПЦР-анализа, позволяющего обнаружить и дифференцировать КЧС и АЧС (Африканскую чуму свиней) синхронно в одной пробирке. Объединение двух тестов в один не сказалось на чувствительности, также есть дополнительный контроль для выявления ложноотрицательных проб. В сотрудничестве с Пирбрайтским Институтом мы разработали новые праймеры для АЧС, которые позволили добиться еще более высокой чувствительности по сравнению с тестом на АЧС, предложенным МЭБ.

Сейчас мы разрабатываем новый, изотермический вариант этого теста с целью получения надежного диагностикума, который подошел бы для использования в полевых условиях. Протитип тест-системы опирается на метод RPA (Recombinase Polymerase Amplification, рекомбиназно-полимеразная амплификация), инновационный подход к амплификации ДНК в изотермических условиях под действием фермента рекомбиназы. Тест-системы, основанные на данной методике, высокочувствительны, специфичны, не требуют строгого соблюдения температурного режима и позволяют быстро получить результаты. Главным достоинством такого диагностикума является то, что он не требует ни сложного оборудования, ни денатурации ДНК, требуемое оборудование финансово доступно и на получение результатов уходит лишь около 20 минут.

Эта тест-система может применяться в комбинации с оборудованием, основанным на применении зондов, таком, как колориметрия или капиллярные тест-полоски, подходящими для применения и в лабораторных, и в полевых условиях.

На данный момент мы разработали и получили доказательства высокого качества RPA тест-систем для диагностики отдельно АЧС и КЧС. Результаты обнадеживают: чувствительность этих тестов лишь немного ниже, чем у ПЦР в реальном времени, и намного превышает чувствительность метода изоляции вируса. В нынешнем варианте тесты позволяют детектировать около 1000 копий РНК КЧС и около 10 копий ДНК АЧС. Что касается специфичности, то RPA-тест на КЧС распознавал все 17 из протестированных штаммов, относящихся к 9 из 11 известных генотипов вируса. Перекрестных реакций с другими пестивирусами (ВБВД1 и 2, а также с атипичными) не было.

Сходной специфичностью обладал и RPA-тест для диагностики различных изолятов АЧС. К настоящему моменту тест-система распознает 16 различных изолятов из 6 генотипов, в том числе генотипа II (с Кавказа). Мы предполагаем, что дальнейшая оптимизация поможет еще сильнее повысить чувствительность метода.

Другое заболевание, остающееся глобальной проблемой, – респираторно- репродуктивный синдром свиней (РРСС), вирус которого постоянно эволюционирует и в последнее время иногда вызывает болезнь в более острой форме, чем когда-либо прежде. Особые опасения внушает появление подтипа-3 РРССВ-1, обладающего повышенной патогенностью. Среди примеров штамм “Lena” и белорусский изолят SU1-bel.

Результаты наших исследований говорят о том, что патогенность связана не с повышенной активностью репликации, но коррелирует скорее с развитием более мощного клеточного и гуморального иммунного ответа. При исследовании патогенеза была отмечена повышенная инфильтрация Т-клеток в легкие. Вакцины против РРСС существуют как живые, так и инактивированные, но эффективность их сильно ограничена, защита обеспечивается на непродолжительное время и далеко не от всего разнообразия штаммов вируса. Кроме того, сообщалось о реверсии вакцинного вируса к вирулентной форме.

Мы установили, что иммунный ответ против РРСС со стороны Т-клеток CD8 и CD4, а также синтез интерферона гамма, - все это направлено на определенные консервативные участки белка NSP5 и белка матрикса. Следовательно, именно эти участки могут быть полезны при разработке вакцин нового поколения, направленных на стимуляцию мощного и долгосрочного иммунитета c высоким уровнем защиты против РРССВ независимо от штамма.

В заключение стоит отметить, что классическая и африканская чума свиней, а также репродуктивно-респираторный синдром свиней по-прежнему остаются наиболее значимыми заболеваниями свиней в Европе и России. Понимание принципов иммунного ответа в будущем позволит нам разрабатывать более надежные вакцины, особенно это касается стимуляции клеточного иммунитета, так как он наиболее важен для формирования долгосрочной защиты. Также интересен сценарий использования противовирусных препаратов, хотя его реализация возможна лишь в еще более отдаленном будущем. Сотрудничество между учеными и обмен информацией как никогда важны для продвижения к нашей общей цели, победе над этими и другими заболеваниями и обеспечению продовольственной безопасности во всем мире.