Доклад руководителя отдела молекулярной и клеточной биологии Национального центра биотехнологии (Испания) Луиса Энхуанеса на Международном ветеринарном конгрессе в Казани.

Луис Энхуанес, Соня Суньига, Фернандо Алмасан, Карлос Санчес и Исабель Сола
Отдел молекулярной и клеточной биологии Национального центра биотехнологии при Мадридском автономном университете, Испания

Острые инфекционные диарейные заболевания характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью среди поросят. Существует три основных вируса свиней, ответственных за эту патологию: ротавирусы группы А (PRV-A), вирус трансмиссивного гастроэнтерита (ТГС) и вирус эпидемической диареи свиней (ЭДС). Ротавирусы относятся к семейству Reoviridae и являются наиболее распространенным возбудителем гастроэнтерита у свиней. Вирусы же ТГС и ЭДС относятся к семейству Coronaviridae. Возникнув сравнительно недавно, они стали крайне опасны для свиней и человека. Данные эмерджентные коронавирусы становятся причиной энтеритов у свиней любого возраста, в частности приводя к летальному исходу среди новорожденных поросят, в результате чего имеет место серьезный экономический ущерб. Симптомы и очаги поражения при данных энтеритах сходны. Вирус разрушает энтероциты ворсинок, что приводит к атрофии ворсинок в тонком кишечнике и, как следствие, к диарее (обильные водянистые фекалии), тошноте, обезвоживанию и высокой смертности среди поросят-сосунов. Поэтому важно быстро обнаруживать данные вирусы. чтобы иметь возможность предотвратить их дальнейшее распространение путем вакцинации и прибегая к другим мерам контроля.

В этом докладе мы сосредоточимся на свиных коронавирусах, поскольку недавно появились представляющие опасность для промышленного свиноводства новые вирулентные штаммы вируса ЭДС, а также новые коронавирусы, отличные от вирусов ТГС и ЭДС, недавно появившиеся в Гонконге и штате Огайо (США).

Коронавирусы продемонстрировали способность пересекать межвидовые барьеры и не так давно стали причиной зооноза. В 2002-03 гг. на юге Китая возник прежде неизвестный коронавирус, способный вызывать заболевание и человека, и животных, - вирус атипичной пневмонии (SARS-CoV). Около 8000 человек были заражены и приблизительно 10% из них умерли. Летом 2012 года на Аравийском полуострове возник вирус ближеневосточного респираторного синдрома (MERSCoV), и с тех пор на его счету более 180 госпитализаций и около 80 смертей. В 201 году в Китае появился высоковирулентный ЭДС, а три года спустя был замечен в США, распространившись на территории более чем 20 штатов. В феврале 2014 году данный вирус был также обнаружен в Канаде. Не менее интересно то, что прежде неизвестный коронавирус, вызывающий аналогичное ТГС и ЭДС заболевание, но обладающий совершенно иной последовательностью генома, был выделен в феврале 2014 года в штате Огайо. Вирус этот близок выделенному в 2013 году в Гонконге. Данный новый коронавирус скорее всего намного шире распространен, однако не был идентифицирован по той причине, что о его существовании до недавнего времени не было известно. В то время как вирусы ТГС и ЭДС согласно классификации относятся к альфа-коронавирусам, новый вирус был отнесен к дельта-коронавирусам и получил название дельта-коронавируса свиней (SDCV, swine delta coronavirus).

На территории России ЭДС обнаруживали по меньшей мере начиная с 2005 года. Более того, в 25% случаев диареи у свиней животные были серопозитивны по ЭДС. Эти данные в очередной раз говорят о том, что в мире постоянно появляются новые коронавирусы как животных, так и человека, представляя угрозу для здоровья людей и промышленного животноводства. Коронавирусы уже были найдены во всех видах животных, поиск коронавирусов которых предпринимался. Вирус SARS-CoV как правило передавался человеку пальмовыми куницами (мусангами), вирус же MERS-CoV скорее всего был передан верблюдами. Для ТГС и ЭДС способность передаваться человеку либо другим видам животных в целом нехарактерна.

Вирус ЭДС впервые был идентифицирован в Англии в 1971 году, впервые выделен в Бельгии в 1978 году, а с 1980 по 1990 гг. распространился на территории большей части европейских стран. В Китае данный вирус впервые был обнаружен в 1986 году, а в России – в 2005. В настоящее время высоковирулентные изоляты вируса были получены в Азии и Северной Америке. При сравнении геномов внутри одного семейства, последовательности генов полимеразы как правило максимально схожи. Так, они совпадали на 99% для различных изолятов вируса ЭДС, полученных в Китае в 2012 году, и превышала этот показатель для изолятов, выделенных в США в 2013 году. При сравнении последовательностей гена полимеразы китайских и американских изолятов вируса ЭДС, сходство также было значительным, но падало до 97-99%, что указывает на возможность происхождения появившегося в США в 2013 году вируса ЭДС от того, что циркулировал в Китае в 2010-2011 гг.

В прошлом было проведено разграничение между двумя типами вируса ЭДС: тип 1 встречался лишь у взрослых животных без проявления клинических признаков у поросят-сосунов, в то время как тип 2 заражал животных безотносительно их возраста. Репликация вируса ЭДС протекает в тощей, подвздошной (в боковых стенках виллей, по краям крипт) и ободочной кишках, вирус же ТГС заражает целиком реснички, не затрагивая клеток крипт и ободочной кишки. В целом смертность при ЭДС превышает смертность при ТГС на 10% среди поросят в возрасте до 2 недель и на 20% среди поросят в возрасте от 2 до 4 недель.

К настоящему накоплен большой объем информации по последовательностям изолятов вируса ЭДС, выделенных в разных частях света: известны полные последовательности 23 штаммов. На основании последовательностей гена полимеразы можно заключить, что циркулировавшие в 2005-2007 гг. в России штаммы родственны в первую очередь изолятам, полученным в Китае и Корее. В ходе сравнения 23 полных последовательностей, имеющихся на сегодняшний день, были дифференцированы две основные клады вируса, названные 1 и 2, и каждая была поделена на две геногруппы (1а и 1б, 2а и 2б). Ранее всего выделенные штаммы, такие, как прототипический бельгийский CV777, относятся к геногруппе 1а, к геногруппе 1б были отнесены штаммы, близкие к вирусу из корейской аттенуированной вакцины на основе изолята DR13. Недавно идентифицированные китайские и североамериканские изоляты вирусов, возникших, соответственно, в 2010 и 2013, для которых сходство последовательностей генома превышало 99%, были выделены в геногруппу 2а, в то время как геногруппа 2б включила в себя изоляты вирусов, циркулировавших в Китае в течение 2011 и 2012 гг. Есть основания полагать, что циркулирующий в 2014 году в Китае штамм вируса ЭДС имеет шансы появиться в России в обозримом будущем.

В прошлом был описан рецептор вируса ТГС: его роль выполняет аминопептидаза N, белок, в изобилии представленный на поверхности клеток кишечного эпителия свиней, рецептор же вируса ЭДС пока что обнаружен не был. Процент перекрестных реакций между этими двумя вирусами крайне низок, даже при использовании антител к разным структурным белкам. К сожалению, данных по перекрестным реакциям различных геногрупп на данный момент нет, и ввиду этого неизвестно, способны ли вакцины против одной из геногрупп защищать против всех остальных. Тем не менее, на основании того обстоятельства, что свиньи из хозяйств Китая, иммунизированные вакциной на основе классических европейских штаммов, вскоре после вакцинации были инфицированы незадолго до того возникшими штаммами ЭДС, с высокой степенью вероятности можно предположить, что старые и новые штаммы ЭДС, присутствовавшие в этих хозяйствах, относятся к разным серотипам, не вступающим в перекрестные реакции.

Серологическое разнообразие вируса ЭДС не было досконально изучено иммунологическими методами. Однако было показано, что в индукции вируснейтрализующих антител принимают участие три области глобулярного домена S-белка, что сходно с данными по ТГС. Задачу разработки универсальной вакцины значительно облегчила бы высокая консервативность хотя бы одной из этих областей от геногруппы к геногруппе, как у ТГС и вируса SARS-CoV.

Дифференциальная диагностика ЭДС основана главным образом на идентификации геномной последовательности после амплификации методом обратной ПЦР. Среди доступных на рынке диагностикумов недавно появился набор для проведения мультиплексной гнездовой обратной ПЦР, разработанный в России (Larissa et al., 2010). Эта тест-система позволяет одновременно протестировать биоматериал на присутствие реовирусов свиней группы А, а также вирусов ТГС и ЭДС.

Основной стратегией защиты хозяйств от ЭДС и ТГС является соблюдение правил содержания животных, так как кишечные коронавирусы передаются контактным способом. Поэтому крайне важно исключить возможность трансмиссии через механические векторы (обувь, одежда, транспортные средства). Особенно это важно на фоне ограниченной эффективности доступных на рынке вакцин. Также полезны могут быть такие меры, как отдельное содержание новоприобретенных животных в течение по меньшей мере 4 недель и введение в поголовье только серонегативных животных. Также надлежит избегать контакта с собаками, кошками, лисицами и другими дикими животными. Помимо этого очень важно соблюдать принцип «пусто-занято» “all-in/all-out”.

Если вспышка заболевания уже имеет место, оптимальным решением будет: 1) увеличить температуру в помещении до 32ºC для предотвращения сквозняков (особенно хорошо, если полы на фермах немного приподняты), сделать свободным доступ к воде, раствору электролитов или заменителю молока, а также антибактериальное лечение; 2) воспользоваться коммерчески доступными вакцинами для стимуляции пассивного иммунитета у поросят-сосунов для снижения их смертности; 3) провести перезаражение животных вирусом по меньшей мере за 2 недели до опороса.

Наибольшим потенциалом обладают вакцины, направленные на стимуляцию мукозного иммунитета в кишечнике. Оптимальный способ вакцинации по этой причине – оральный, при этом аттенуированный вирус проникает в просвет кишечника. Такая вакцинация способна защитить до 90% помета от привитой свиноматки. Существует несколько типов вакцин, способных предотвратить ЭДС 1) вакцины «домашнего приготовления» на основе перемолотых кишок инфицированных животных; 2) классические инактивированные вакцины; 3) модифицированные аттенуированные вакцины, приготовленные из вирусов, прошедших серию пассажей в клеточной культуре; 4) современные рекомбинантные вакцины; 5) вакцины на основе вирусов, способных к репликации, но не к размножению. Я подробнее остановлюсь на плюсах и минусах этих типов вакцин.

Вакцины «домашнего приготовления» представляют слишком серьезную опасность для хозяйств и использоваться не должны. Так, скармливание свиньям фрагментов кишечника животных с других ферм приводило к нежелательным результатам, а именно к появлению в таких хозяйствах персистентной коронавирусной инфекции, а также к проникновению других вирусов, таких как РРСС и цирковирусы.

Классические инактивированные вакцины не обеспечивают высокого уровня защиты, при том что иммунитет сохраняется лишь ненадолго. На основании полевых исследований хорошо известно, что для защиты кишечника от вирусов ТГС и ЭДС необходима стимуляция местного (секреторного) иммунитета, особенно у поросят младше 2 недель. Для защиты же новорожденных потребуется лактогенный иммунитет. Такая стимуляция иммунитета с наибольшей эффективностью происходит после иммунизации лимфоидных органов, ассоциированных с пищеварительным трактом. Иммунизация с помощью убитых вакцин секреторный иммунитет не стимулирует, однако было обнаружено, что они способны усиливать действие живых аттенуированных вакцин.

Живые аттенуированные вакцины, полученные из вирусов, прошедших от 90 до 100 пассажей в клеточной культуре. Вакцины эти были разработаны в Китае, Японии и Корее и обеспечивают сравнительно адекватный уровень защиты, не исключая, однако, возможности выделения животными вируса, что обычно является критерием эффективности вакцины. Вакцины этого типа потенциально обладают способностью реверсии к вирулентности in vivo. К сожалению, подобный побочный эффект наблюдали для одной из корейских вакцин, приготовленной на основе штамма DR13. От данного вакцинного штамма скорее всего ведет свое происхождение ряд изолятов вируса ЭДС, полученных в Китае и Корее после применения этой вакцины в поле.

Рекомбинантные живые аттенуированные вакцины против вирусов SARS-CoV и MERS-CoV были получены с помощью инфекционных кДНК-клонов. Благодаря этим кДНК-клонам стало возможно вносить модификации в любую область вирусного генома. Вспомним, что большинство вирусов вирулентны не потому, что эффективно реплицируются, а ввиду тканеспецифического тропизма или же наличия генов вирулентности. Так, если вирус поражает жизненно важные органы (такие, как мозг или сердце) или в его геноме закодированы белки, вмешивающиеся в механизмы защиты хозяина (такие, как интерфероны), то вирус вирулентен. Удаление последовательностей этих генов делает вирус более уязвимым для этих защитных механизмов, то есть делают его аттенуированным. Данная стратегия позволила разработать качественные вакцины против вирусов ТГС и SARS-CoV, в настоящее время ведутся разработки для вируса ЭДС. Инфекционные кДНК-клоны (то есть копии генома) вируса ЭДС встраиваются в плазмиды для обеспечения стабильности клонированной ДНК. Плазмиды представляют собой бактериальные хромосомы искусственного происхождения. Необходимо принять меры предосторожности для предотвращения реверсии вируса к вирулентности – для этого проводят селекцию вирусов с компенсаторными мутациями либо рекомбинацию с вирулентным полевым штаммом.

Оптимальной с точки зрения безопасности и эффективности была бы вакцина на основе вируса, способного к репликации, но неспособного к распространению по тканям хозяина. Вирус в составе таких вакцин размножается в тех же очагах, что характерны для дикого вируса, однако неспособен распространиться даже в соседнюю клетку, что исключает возможность реверсии к вирулентности. Антиген же вырабатывается в инфицированных клетках в количестве, в несколько тысяч раз превышающем изначальное. Вакцинный вирус можно будет выращивать, поставляя недостающие белки in trans. Такие вакцины безусловно являются наиболее эффективными и безопасными, а также обеспечивают продолжительный иммунитет.

В заключение, следует отметить, что существует несколько взаимодополняющих подходов для получения безопасных и эффективных вакцин, защищающих здоровье человека и животных от эмерджентных коронавирусов, однако эффективность и безопасность различных подходов может существенно варьироваться. В случае недоступности высококачественной вакцины следует обеспечить безупречные условия содержания животных.